赵皖秋, 任文娟, 李伟, 刘珊·(陕西省妇幼保健院生殖中心.西安 710003)【摘要】 目的 检测父/母为乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染者的胚胎中是否存在 HBV DNA,探讨 HBV经配子垂直传播的可能性,同时评估影响垂直传播发生的相关因素。 方法 收集单方 HBV感染的229对夫妻的3lo个废弃胚胎。采用套式聚合酶能反应(PCR)法测定胚胎样本中的 HBV DMA。采用 Logistic回归分析患者年龄、血清 HBV DNA载量、血清HBV多种抗原或抗体存在情况及授精方法等因素与 HBV DMA存在的相关性。 结果 7 74%(24/3lo)的胚胎中检出了HBV DNA;血清 HBV DNA载量与胚胎中存在 HBVDMA呈显著正相关[CIR4 l28,95% Cf(l. 3l9,l2 9l4),P=0 0l5];授精方式(IVF或 ICSI)的差异对胚胎 HBV DNA阳性检査率几乎无影响(P>0 o5);同一对夫妻的多个胚胎中只有部分胚胎存在 HBV DNA。 结论 垂直传播可能是 HBV重要的传播途径之一。对子 HBV DNA高载量的父/母,自然受孕或助孕治疗前建议进行针对性治疗,以降低胚胎感染 HBV的风险 。【关键词】 乙型肝炎病毒; 胚胎; 垂直传播; HBV载量 乙型肝炎病毒( HBV)感染可导致急\慢性肝炎、肝硬化以及肝细胞癌, 全球约20亿人感染HBV,其中超过3. 50亿人为慢性感染,中国做为 HBV感染高发地区,约60%的中国人有 HBV 感染史, 9. 8%的中国人为 HBV慢性感染者。 HBV感染高发的一个重要原因是 HBV可以垂直传播,估计超过30%的 HBV感染是通过母婴垂直传播获得。母婴垂直传播可分为产前传播、产时传播及产后传播, 产前传播也称宫内传播,通常认为 HBV突破胎盘屏障是造成胎儿宫内感染的最主要原因;产时传播主要是指胎儿在分娩过程中,由于宫缩而吞咽含有 HBV的母体血液、羊水以及阴道分泌物等母体体液,或因为胎意血管破裂,母血渗入胎儿血液中造成母婴垂直传播;产后传播即通过接触父母唾液、母乳喂养以及其他生活上的密切接触而造成的 HBV感染。 传统观念认为,乙肝的垂直传播就是母婴垂直传播,但自 Hadchoue1等研究发现 HBV DNA可整合到精子基因组中后,越来越多的研究提示 HBV可能经过精子垂直传播。近期的研究则发现 HBV DNA可整合入仓鼠卵母细胞基因组中, HBV感染者不同发育阶段的卵母细胞均可检出乙肝核心抗原(HBcAg)和 HBV DNA,提示 HBV感染可能经过生殖细胞(精子和卵母细胞)发生垂直传播。 目前,虽然有间接证据提示 HBV可能通过感染生殖细胞进行垂直传播,但尚缺乏足够的直接证据支持, 本研究通过检测父/母为 HBV慢性感染者的废弃胚胎中是否存在 HBV DNA,为 HBV是否可通过生殖细胞传播提供直接证据,同时评估影响该垂直传播发生的相关因素。
材料与方法一、主要设备与试剂 Applied Biosystems Veriti96 We11 Therma1 Cycler PCR仪购自美国 Life Techno1ogies公司; Bio-RAD PowerPac电泳仪购自美国伯乐公司;JS680CR全自动凝胶成像分析仪购自上海培清科技有限公司;HBV DNA Detection试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。
二、研究方法 1z样本收集及处理:实验样本来源于2012年9月至2014年3月在我院辅助生殖中心行辅助生殖助孕治疗、单方 HBV感染的229对不育夫妇的废弃胚胎(共310个), 本研究将乙肝表面抗原( HBsAg)阳性持续半年以上者认定为 HBV感染, 从单纯男方 HBV感染的140对夫妇中获得废弃胚胎181个,从单纯女方 HBV感染的89对夫妇中获得废弃胚胎129个,本研究经我院伦理委员会审议通过,并患者知情同意. 上述单方 HBV感染者均进行了乙肝七项检测:乙肝表面抗体(HBsAb)、乙肝 e抗原(HBeAg)、乙肝 e抗体(HBeAb)、乙肝核心抗体(HBcAb)、乙肝核心 IgM型抗体(HBcAb-IgM)和乙肝 S1抗原(HBSIAg)及血清 HBV DNA载量测定。 另外,选取同期在我院接受辅助生殖助孕旅行青蛙 知乎治疗、未感染 HBV的不育夫妇的废弃胚胎80例做为阴性对照。 本研究所纳入胚胎均为
人工授精后培养 72 h的废弃胚胎(异常受精或低于移植标准的胚胎), 经PBS清洗3次后,用毛细吸管将胚胎移入聚合酶链反应(PCR)管底,液氮冻存备用。
三、HBV DNA检测 使用 HBV DNA Detection试剂盒检测胚胎中是否存在 HBV DNA。采用套式 PCR法特异性扩增乙肝病毒 DNA中的 S基因(基因序列第506~ 645) ,S基因编码合成乙肝表面抗原的主蛋白,其与前 S抗原共同组成乙肝表面抗原。因商品试剂盒PCR引物序列保密,故本文不能提供引物序列信息。首次 PCR扩增的产物大小约510 bp,二次PCR扩增的产物大小约230 bp。以试剂盒提供的阳性模版做为阳性对照,其首次 PCR扩增产物大小约603 bp,次 PCR扩增产物大小约350 bp。 套式 PCR操作如下:向含有胚胎样本的 PCR 管中直接加入 PCR反应液25 µ1,振荡、离心后,按以下条件进行第1次扩增:94℃预变性1 min,94℃变性30 s,55℃复性30 s,72℃延伸30 s,共30个循环;再取2 µ1第1次扩增产物做为模版,加入23 µ1 PCR反应液,按以下条件进行第2次扩增: 94℃变性30 s,55℃复性30 s,72℃延伸30 s,共35个循环, 扩增产物进行 2%的琼脂糖凝胶电泳,显示特异性扩增条带者视为 HBV D1、1A阳性。 HBV DNA载量的测定,则按照临床常规,由我院临床检验科统一测定。
四、统计学分析 采用 SPSS13. 0软件进行数据统计分析,分类变量比较来用卡方检验,相关性分析来用 Logistic 回归分析, P<0 05为差异具有统计学意义。
结 果一、PCR检测结果 单纯男方 HBV感染的140对夫妻中13例(9.3%)检测到 HBV DNA阳性胚胎,单纯女方HBV感染的89对夫妻中11例(12. 4%)检测到阳性结果(表1)。 在所检测的310例胚胎样本,检出 HBV DNA 阳性胚胎样本24个,检出率为7. 74%。其中男方HBV感染者来源的181例胚胎中检出13例阳性, 检出率为7. 18%;女方 HBV感染者来源的129例胚胎中检出11例，检出率为8.53%。经卡方检验，两者检出率无显著性差异（P＞0.05）。 80例阴性对照胚胎未有阳性结果检出。
二、胚胎 HBV感染相关性因素分析 胚胎 HBV感染相关性因素分析来用 Logistic 回归分析,入选因素包括:男/女方年龄、 HBsAb、HBeAg、 HBeAb、 HBcAb、 HBcAb-IgM、 HBSIAg、血清 HBV D1、1A载量和授精方式[体外受精( IVF) 或卵胞浆内单精子注射(ICSI)]。 Logistic回归初始模型分析发现 HBeAg阳性、HBeAb阳性和 HBV DNA高载量(HBV DNA拷贝数>106/m1)与胚胎 HBV感染具有显著相关性(P<0 .05)。排除混杂因素后,Logistic回归分析发现仅 HBV DNA高载量与胚胎 HBV感染呈显著正相关[0R4 128,95% CI(1. 319,12. 914),P= 0 .015](表2)。此外,单独对单纯男/女方为 HBV 感染者的样本来用卡方检验和 Logistic回归分析发现:授精方式(IVF或 ICSI)的差异对胚胎感染HBV的几率无显著影响(P>0 05)(表1)。 研究结果还发现:4对单纯男性 HBV感染和5 对单纯女性 HBV感染夫妻同一批次多个胚胎中, 仅有1个胚胎检出 HBV DNA,并非所有受检胚胎 HBV DNA均为阳性（表3），提示源于同一对夫妻的多个胚胎中只有部分胚胎感染HBV。
讨 论 Hadchoue1等研究首次发现 HBV DNA可退出全屏整合到精子基因组中,其他研究通过荧光原位杂交方法亦观察到 HBV的基因序列整合到精子染色体上。 Ali等从分化出1~2个细胞的胚胎中发现了 HBV基因,而该胚胎来源于感染了 HBV的人类精子与仓鼠去透明带卵母细胞的体外受精操作。以上研究提示 HBV可能经精子垂直传播给胚胎。对女性 HBV感染者的研究-也发现, HBsAg、HBcAg和 HBV DNA在不同发育阶段的卵细胞和卵巢组织中均可检出,且 HBV DNA可整合入仓鼠卵母细胞基因组中,提示 HBV也可能经卵细胞垂直传播,但是,目前对于 HBV通过生殖细胞垂直传播的直接证据研究尚少, 本研究结果显示,单纯男方 HBV感染的140对夫妻中13例(9 .3%)胚胎检测到阳性结果,单纯女方 HBV感染的89对夫妻中11例(12. 4%)胚胎检测到阳性结果,在体外条件下的废弃胚胎中检测到 HBV DNA，提示人类精子或卵细胞可能作为裁体将 HBV传播给胚胎。上述实验结果为“HBV经生殖细胞垂直传播”的假说提供了直接证据。 本研究还发现，源于同一对夫妻的同批次多个胚胎，只有部分胚胎检出HBV DNA，表明HBV对精子和卵母细胞的感染具有一定限制性，其具体机制尚需进一步的研究。其中不同卵母细胞感染HBV的差异性，可能与卵母细胞透明带的高度异构性有关。此外,在本研究中,废弃胚胎中的 HBV DNA需重复 PCR后才能检测到,表明HBV DNA 在感染胚胎中含量极低,提示HBV DNA在胚胎中不复制或仅极低水平的复制,其具体发生机制亦需要后续的深入研究来验证。 与模拟自然受精的 IVF不同,ICSI是将精子通过显微注射注入卵母细胞,由于直接跨过了透明带的保护,外部 HBV有可能直接进入胚胎
试管婴儿正常吗,从而增加HBV感染的可能性,因此,欧洲许多国家反对为HBV感染者行 ICSI。 目前,对于使用 HBV感染者精液行 ICSI后是否会增加胚胎 HBV感染率尚存在争议,而对于单纯女性 HBV感染者卵母细胞行 ICSI后是否增加胚胎 HBV感染率则尚无研究报道。 本研究结果显示,单纯男方 HBV感染时,行 ICSI助孕操作后胚胎 HBV DMA的阳性率略高于行 IVF的胚胎,但差异无统计学意义(P> 0 .05) ;单纯女方为 HBV感染时,行 ICSI助孕操作后胚胎 HBV DNA的阳性率低于行 IVF的胚胎,但差异亦无统计学意义(P> 0. 05) 。 ICSI是否会显著增加胚胎感染 HBV的几率,尚需更大样本的研究探讨。 已有研究报道母亲 HBeAg阳性和高血清HBV DNA水平能增加 HBV垂直传播的风险,其中 HBV宫内传播的风险与 HBV DNA水平密切相关, HBV DNA水平较 HBeAg水平更能体现胎儿免疫预防 HBV感染的失败率,为确定经生殖细胞垂直感染 HBV与 HBeAg阳性、高血清 HBV DNA水平等影响因素的相关性,本研究分析了男/女方年龄
试管婴儿常见问答、 HBsAb、 HBeAg、 HBeAb、HBcAb、HBclgM-Ab、HBSIAg及血清 HBV DNA 载量等因素与胚胎 HBV感染的相关性。经 Logistic 回归分析发现仅血清 HBV DNA高载量与胚胎HBV感染呈显著性正相关,表明高浓度的 HBV环境可显著增加胚胎 HBV感染率,提示 HBV感染者孕前应检测血清 HBV DNA载量,对于高载量的患者应进行相应治疗,在降低HBV DNA载量后再怀孕，以降低胚胎感染HBV的可能性。 综上所述，无论男方或女方感染HBV，均可能出现胚胎，提示经生殖细胞（精子和卵母细胞）垂直传播可能是HBV重要的传播途径之一。对于男方或女方感染HBV者，临床上进行ICSI或IVF辅助治疗前要进行综合评价，对于HBV DNA高载量的父/母，自然受孕或进行辅助生殖助孕治疗前均应进行针对性治疗，以降低胚胎感染HBV的风险。柬埔寨皇家生殖遗传医院RFG祝您“好孕”！ （更多详情，可咨询，QQ:473505883 124348622 电话： 400-6969-601）
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